CRISPR-Cas: tijd om zwaarden om te smeden tot ploegen

We staan aan het begin van een nieuw tijdperk: de heilige graal van moleculaire geneeskunde is door de ontwikkeling van de CRISPR-Cas technologie binnen handbereik. Planten, voedsel, genetische ziekten en plots ook embryo’s zijn genetisch aanpasbaar. De kansen van op CRISPR gebaseerde genoombewerking worden alleen beperkt door onze genetische inzichten, onze collectieve verbeeldingskracht en niet in de laatste plaats door wat we ethisch aanvaardbaar vinden. Maar, wat is de limiet?

In een poging de wereld te verbeteren, sprak de profeet Jesaja legendarische woorden: “Laten we de zwaarden omsmeden tot ploegen, en de speren tot snoeimessen”. Wat Jesaja niet kon vermoeden was dat deze uitspraak niet alleen een inspiratiebron is geweest voor pacifisten onder ons, maar ook voor microbiologen. In microbiologische laboratoria verspreid over de hele wereld, waaronder in Wageningen, heeft fundamenteel onderzoek aan “biologische wapens” onlangs de basis gelegd voor uiteenlopende toepassingen in de biotechnologie en in de gezondheidszorg.

“CRISPR-Cas. Tijd om zwaarden om te smeden tot ploegen! Lees meer over CRISPR in het opiniestuk van Prof. Microbiologie John van der Oost @WUR ”
Tweet this!

Bacteriën hebben, net als planten en dieren, continu te maken met infecties door virussen. Het is dan ook niet verwonderlijk dat bacteriën eveneens beschikken over anti-virus afweersystemen. De meest geavanceerde bacteriële verdedigingsstrategie is zonder twijfel het recent ontdekte CRISPR-Cas-systeem. Na het ophelderen van het werkingsmechanisme van dit CRISPR-Cas systeem, zijn nu spectaculaire toepassingen mogelijk in gebieden variërend van biotechnologie tot menselijke gentherapie. Met andere woorden: een microbieel anti-virus systeem kan een heel grote impact hebben op ons leven in de nabije toekomst.


Wat is CRISPR?

Alle levende organismen gebruiken DNA voor de opslag van hun erfelijke informatie. Het DNA vormt de chromosomen: zeer lange kettingen die zijn opgebouwd 4 kralen (de DNA bouwstenen: G, A, T, C). Mensen hebben 23 verschillende chromosomen met in totaal 3 miljard bouwstenen, terwijl bacteriën er meestal maar één hebben met gemiddeld 3 miljoen bouwstenen. Toen twintig jaar geleden veel bacteriële chromosomen in detail werden geanalyseerd, bleek dat in de helft hiervan repeterende stukjes (‘repeats”) voorkomen met daartussen variabele stukjes (“spacers”), die samen CRISPRs worden genoemd (“Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”). Naast deze repetitieve DNA clusters, liggen de CRISPR-geassocieerde cas-genen die de genetische code bevatten van de Cas enzymen. Tien jaar geleden werd aangetoond dat dit CRISPR-Cas systeem een uniek anti-virus systeem is, met een ingenieus mechanisme. Wanneer een bacterie door een virus wordt geïnfecteerd, wordt het genetisch materiaal van het virus (meestal DNA) overgedragen naar de bacteriële gastheer cel. Onder bepaalde omstandigheden kan de bacterie immuniteit verkrijgen door fragmenten van het virus DNA op te nemen als nieuwe (repeat-spacer) eenheden in de CRISPR op zijn chromosoom (Figuur 1). Deze CRISPR is dus het geheugen van het anti-virus afweersysteem, vergelijkbaar met een soort archief met vingerafdrukken van inbrekers. Bij een nieuwe infectie door zo’n virus, kan het DNA van de indringer specifiek worden herkend. Dit is mogelijk omdat de informatie die is opgeslagen in het CRISPR archief, vanuit het CRISPR-DNA wordt overgeschreven tot een klein CRISPR-RNA, dat dient als gids voor een Cas-enzym om een ​​match met het virale DNA-sequentie te vinden, waarna dat zal worden geknipt en vernietigd (Figuur 1).

Figuur 1. Schematische weergave van werkingsmechanisme van het CRISPR-Cas systeem. Dit anti-virus mechanisme verloopt via drie verschillende stappen. (1) Acquisition. Inbouw van kleine stukjes virus DNA als nieuwe spacer van het CRISPR archief. (2) Expression. Het overschrijven van de informatie opgeslagen in het CRISPR DNA naar CRISPR RNA (crRNA) dat uiteindelijk als gids dient om een match te vinden met virus DNA. (3) Interference. Na infectie van een virus waarvan al informatie is opgeslagen in het CRISPR geheugen, vindt herkenning van het virus DNA plaats, waarna het kapot geknipt wordt zodat het virus onschadelijk is gemaakt.  


Potentieel van CRISPR-systeem

Het ontrafelen van de moleculaire details van het CRISPR-Cas mechanisme (Figuur 1), heeft de ontwikkeling mogelijk gemaakt van nieuwe gereedschappen voor genetische manipulatie. Wanneer Cas enzymen (bijvoorbeeld Cas9 of Cpf1 nucleasen; Figuur 2A) worden uitgerust met specifiek ontworpen CRISPR-gids moleculen, vindt specifieke herkenning, binding en splitsing plaats van een complementaire DNA-sequentie (Figuur 2). Wanneer het CRISPR-Cas-complex wordt geïntroduceerd in een biologische gastheer cel (bacterie, plant, mens), kan een breuk in het DNA op twee manieren gerepareerd worden door de DNA-reparatiesystemen van de gastheer: (i) niet-homologe recombinatie leidt tot inactivatie van het gen, of (ii) homologe recombinatie in nauwkeurige engineering (Figuur 2B). Dit betekent dat deze nieuwe technologie, naast de engineering van micro-organismen, kan worden gebruikt om heel specifiek het DNA van planten en dieren aan te passen. Bovendien kan op deze manier de DNA-sequentie in menselijke cellen veranderd worden om mutaties te corrigeren die verantwoordelijk zijn voor een genetische ziekte. Het aanpassen van het DNA (‘genoom editing’) kan heel subtiel zijn, zoals het repareren van één enkele fout in de DNA-code van het humane genoom, dus 1 van de 3.000.000.000 bouwstenen! Dit werd altijd gezien als de heilige graal van moleculaire geneeskunde, en door ontwikkeling van de CRISPR-Cas technologie is dit nu binnen handbereik.

Figuur 2. Toepassing van CRISPR-Cas. (A) Schematische weergave van twee Cas enzymen (Cas9 en Cpf1) die veel worden gebruikt voor genoom editing in cellen van bacterien, planten en mensen. DNA (blauw) kan heel specifiek worden herkend door de crRNA gids (rood) van de Cas enzymen, waarna beide DNA strengen geknipt worden (pijlen). (B) Het herkennen en knippen van een specifieke plek in het DNA door een Cas enzym, wordt gevolgd door een reparatie door de cel waarin zich dit afspeelt. Dat kan onnauwkeurig (niet-homoloog) of nauwkeurig (homoloog). In het eerste geval leidt dat vaak tot inactivatie van het gen waaring de knip is aangebracht. In geval van het homologe systeem, kan zeer nauwkeurig het DNA worden aangepast, zodat bijvoorbeeld genetische foutjes kunnen worden aangepast (‘gen therapie’).

Toepassing van CRISPR in dieren en planten

Onlangs is de kracht van de CRISPR-technologie in dieren aangetoond door specifieke, ziekteverwekkende puntmutaties te introduceren in genen van muizen en ratten, zodat ze gebruikt kunnen worden als modellen voor analyse van mensen met vergelijkbare genetische afwijkingen. Verder zijn door het maken van minimale DNA-veranderingen bijvoorbeeld hoorn-loze koeien en steriele zalmen gemaakt. Andere toepassingen zijn het verhogen van de opbrengst van melk, wol en vlees, en het beschermen van dieren tegen infecties door bacteriën en virussen. CRISPR-Cas genen zijn ook geïntroduceerd in het genoom van muggenstammen met als doel snel genetische kenmerken zoals resistentie tegen pathogenen of steriliteit in wilde muggenpopulaties te stimuleren. Dergelijke ‘gene-drive’-strategieën zouden uiteindelijk door muggen verspreide ziekten zoals malaria en Zika kunnen uitroeien zonder het gebruik van giftige insecten-bestrijdingsmiddelen (pesticiden). Een ander voorbeeld betreft het gebruik van CRISPR voor het ‘humaniseren’ van het DNA van varkens. Dit gebeurt door het verwijderen van geïntegreerd viraal DNA (retro-virussen) uit de chromosomen van het varken, waardoor een fundament wordt gelegd voor het toekomstige gebruik van deze dieren als veilige orgaandonoren voor menselijke ontvangers.

In planten heeft op CRISPR-gebaseerde bewerking geresulteerd in ziektebestendige rijst, en in champignons die niet bruin worden als ze worden gesneden. Recent is een spectaculaire aanpassing beschreven van een wilde tomaat (met relatief weinig vruchten ter grootte van erwten) naar een tomaat die qua opbrengst niet onderdoet voor de tomaten die nu bij de groentenboer liggen. Deze ‘gedomesticeerde’ tomaten zijn voortgekomen uit een klassiek kruisingsproces van vele honderden jaren, waarbij met name geselecteerd is voor een grotere opbrengst. Deze vorm van selectie is ten koste gegaan van een aantal oorspronkelijke eigenschappen van de wilde tomaat, zoals smaak, voedingswaarde en bepaalde vormen van ziekteresistentie. Door slechts 6 genen van de wilde tomaat te inactiveren is onlangs met CRISPR-Cas binnen een paar maanden een tomatenplant gecreëerd met een vergelijkbare verhoging van de opbrengst, maar nu ook met behoud van smaak en voedingswaarde.

Belangrijk is dat het met de CRISPR-Cas benadering nu mogelijk is om heel kleine genetische veranderingen te genereren waarbij er geen vreemd DNA in het betreffende organisme wordt geïntroduceerd. Bovendien kunnen dergelijke puntmutaties worden geïntroduceerd die niet verschillen van natuurlijke mutaties. Door te kijken naar het eindproduct in plaats van naar het productieproces is in landen als de VS en Japan besloten om dergelijke planten en dieren niet te beschouwen als “genetisch gemodificeerde organismen” (GGO’s). Omdat hierdoor het zeer langdurige en kostbare GGO-onderzoekstraject niet meer vereist is, betekent dit dat ze relatief snel geïntroduceerd kunnen worden op de levensmiddelenmarkt. Het is te hopen dat het doordringt tot de beleidsmakers, zeker in Europa, dat het de hoogste tijd is om de GGO wetgeving zo aan te passen dat er met volle kracht gewerkt kan gaan worden om, met de groeiende bevolking op een opwarmende planeet, de veilige en duurzame productie van voldoende gezond voedsel ook in de toekomst te kunnen garanderen.

CRISPR voor humane gentherapie

Hoewel CRISPR-toepassingen in de flora en fauna van de planeet al opwindend zijn, is de impact van het bewerken van genen in mensen waarschijnlijk nog veel groter. Aan de ene kant vormen de mogelijkheden van CRISPR-Cas een enorme belofte, maar aan de andere kant wordt het gezien als een potentiële bedreiging. Voor veel genetische ziekten kan CRISPR worden gebruikt om de gemuteerde genen bij patiënten te repareren. Een reeks van laboratoriumexperimenten hebben de afgelopen jaren inderdaad de verbluffende mogelijkheden laten zien. In geïsoleerde menselijke cellen is CRISPR recentelijk gebruikt voor het corrigeren van de mutaties die verantwoordelijk zijn voor cystic fibrosis, sikkelcelanemie, een bepaalde vorm van blindheid, een ernstige vorm van immunodeficiëntie (de “bubble boy” -ziekte), en nog veel meer andere ziekten. Onderzoekers hebben ook de CRISPR-technologie gebruikt om de fouten te corrigeren die leiden tot Duchenne-spierdystrofie, door precies het beschadigde gebied uit het gemuteerde gen te verwijderen, terwijl de rest ongewijzigd blijft. CRISPR is zelfs gebruikt als een mogelijke behandeling voor AIDS, door het HIV-virus DNA uit geïnfecteerde cellen te knippen.

Omdat CRISPR het mogelijk maakt om op een precieze en relatief eenvoudige manier DNA te bewerken, is elke genetische ziekte die wordt veroorzaakt door een enkele onderliggende mutatie nu potentieel behandelbaar. Zelfs sommige vormen van kanker kunnen binnenkort worden behandeld door de immuuncellen uit het bloed van een patiënt met behulp van de CRISPR-technologie te programmeren, zodat deze met een hogere efficiëntie tumoren kunnen opsporen en vernietigen. Hoewel er nog veel werk aan de winkel is voordat op CRISPR-gebaseerde therapieën beschikbaar zullen zijn voor menselijke patiënten is hun potentieel duidelijk. De stormachtige ontwikkeling van het CRISPR veld heeft gentherapie een stuk dichterbij gebracht. De kans is groot dat dit binnen 10 jaar levens van patiënten ingrijpend gaat veranderen.

Wat is de limiet?

In plaats van de behandeling van genetische ziekten, kan zelfs overwogen worden om CRISPR te gebruiken om ziekten te voorkomen. Je zou dit kunnen doen door het DNA te bewerken van geslachtscellen (eicellen, spermacellen) of van embryo’s. De CRISPR-technologie kan erfelijke genetische veranderingen veroorzaken wanneer deze worden gebruikt om de zogenoemde ‘kiembaan’ te veranderen – de genetische informatie die de ene generatie met de andere verbindt. Ervan uitgaande dat het bewerken van genen veilig en doeltreffend kan worden uitgevoerd, kan het wenselijk zijn om ziekteverwekkende mutaties permanent te herstellen voordat ze menselijk leed veroorzaken.

Maar als het eenmaal mogelijk wordt om de DNA-sequentie van gemuteerde genen terug te brengen naar hun ‘normale’ versies in embryo’s, kan de verleiding ontstaan ​​om ‘normale’ genen te veranderen naar zogenoemd ‘superieure’ varianten. Op basis van onduidelijke gezondheidsrisico’s en ethische aspecten zijn CRISPR onderzoekers en beleidsmakers overeengekomen dat het embryo onderzoek vooralsnog fundamenteel moet zijn en na twee weken moet worden afgebroken. Desondanks zijn er onlangs in China twee baby’s geboren waarvan het DNA op embryo niveau is aangepast ter preventie van infectie door het HIV virus. Dit heeft geleid tot scherpe veroordelingen wereldwijd, zowel uit de wetenschappelijke gemeenschap als uit de politiek.

Zeker omdat er technisch gezien heel veel mogelijk is met het CRISPR systeem, is het van groot belang dat er een brede discussie gevoerd wordt over de voorwaarden en grenzen van wat wenselijk en toelaatbaar zou moeten zijn. Er was veel verontwaardiging over genoemde HIV-resistente baby’s. Moeten we aanpassingen van embryo’s altijd verbieden. Of zijn er bepaalde gevallen dat het wel moet kunnen? Moeten we bijvoorbeeld beginnen met het bewerken van genen bij ongeboren kinderen om hun levenslange risico op de ziekte van Alzheimer, hartaandoeningen of diabetes te verlagen? Hoe zit het met het uitrusten van ongeboren kinderen met gunstige eigenschappen, zoals verhoogde kracht en cognitieve vaardigheden, of cosmetische eigenschappen zoals oog- en haarkleur? Wie beslist wanneer de techniek veilig genoeg is, en waar trekken we de grens? In veel gevallen is de nu al gebruikte techniek van embryo selectie een goede manier om gezonde embryo’s te verkrijgen. Misschien moeten we ons daar voorlopig maar toe beperken.

Conclusie

Het CRISPR-verhaal is een prachtig voorbeeld van hoe fundamenteel, nieuwsgierigheid gedreven onderzoek (in dit geval naar een bacterieel afweersysteem) heeft geresulteerd in een technologie die een grote impact kan hebben op onze samenleving. We staan ​​aan het begin van een nieuw tijdperk. Enkele resterende technische uitdagingen van menselijke CRISPR-toepassingen betreffen de specificiteit en het afleveren van het systeem in specifieke weefsels. Afgezien van deze praktische problemen, zijn de kansen van op CRISPR gebaseerde genoombewerking alleen beperkt door onze genetische inzichten, door onze collectieve verbeeldingskracht en niet in de laatste plaats door wat we ethisch aanvaardbaar vinden. Jesaja zou waarschijnlijk trots op ons zijn: de zwaarden worden momenteel omgesmeed in allerlei nuttige ploegen. Als we er verstandig mee om gaan kunnen we daar mooie dingen mee doen.

* Delen van dit artikel zijn gebaseerd op de artikelen ‘Van der Oost (2015) Crystal Ball en op ‘Doudna & Van der Oost (2017) Mighty Microbes’.


Microbioloog en hoogleraar John van der Oost (Wageningen University & Research) stond aan de wieg van de CRISPR-revolutie. Hij was de eerste die de werking van het CRISPR/Cas-afweersysteem ophelderde in bacteriën. Daarmee was hij ook de eerste die CRISPR/Cas inzette om DNA-bewerking toe te passen. Dat schept enorme mogelijkheden voor het genezen van genetische ziekten, en voor biotechnologische toepassingen. In 2018 ontving hij de Spinozapremie.


 

Blijf op de hoogte!

Blijf op de hoogte!

Wil je op de hoogte blijven van toekomstige NRC Live events? Schrijf je dan in voor onze nieuwsbrief!

Suggesties voor een spreker?

Suggesties voor een spreker?

Ken jij iemand die goed zou kunnen spreken op een van onze events? Stel dan een spreker aan ons voor!